DNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型）使用說明書

【產品名稱】

DNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型）

【原理概述】

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術：在常溫恒溫條件下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板，在侵入位點形成D-loop區域，并開始對DNA雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區域后，復合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。依賴nfo酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用膠體金技術（三明治夾心法）可以對最終結果進行檢測。

【產品特點】

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時間短（僅需12 mins）等優點，反應組分為干粉狀態，操作簡便，易于保存。

本試劑對設備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進行反應操作，無需購買PCR擴增儀等價格高昂的專屬設備。

【引物設計】

建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標記一個修飾基團（常用生物素）。引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

【熒光探針設計】

在上下游引物中間，設計一段長度為46-52nt與目的片段互補的序列；5’端修飾一個抗原標記（根據使用試紙條選擇，典型為FAM）; 在5’端和3’末端的中部位置標記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為nfo的識別位點；3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer等。

【試劑盒組成】

【試劑盒儲存】

【操作步驟】

1.提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

2.每個干粉反應管加入10 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混勻，否則會對實驗效果產生影響）；

3.每個反應管分別加入1 μL上游引物、1 μL下游引物和0.4 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應、步驟2和步驟3可以混合后再分裝至反應管中）；

4.向反應管中依次加入3.6 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根據核酸濃度調整加入的核酸模板體積，并相應調整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為5.6 μL）；

5.最后向反應管中加入2 μL B buffer并充分混合（對于多個反應，建議將B buffer加至反應管的蓋子內側，上下顛倒反應管8-10次混勻）；

6.混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入恒溫設備中37-39 oC孵育8-12 mins；

7. 反應結束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 mins內觀察質控線與檢測線判讀結果。

體系配制

【注意事項】

1. 由于試劑盒靈敏度非常高，在進行反應時請注意避免微量核酸污染，并盡量考慮設置空白對照以確認是否有核酸污染。

2. 試劑盒保質期12個月。每次使用時，請取出實驗所需的MIRA反應單元的數量，置于冰浴條件下并在8小時內使用；剩余部分，請置于存儲條件下。

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