Alexa Fluor 647-Streptavidin Alexa Fluor 647標(biāo)記鏈霉親和素
ALEXA FLUOR 647-STREPTAVIDIN（AF647-SA） 是一種將高亮度遠(yuǎn)紅光熒光染料 Alexa Fluor 647 與 鏈霉親和素（Streptavidin, SA） 共價偶聯(lián)的探針，核心用于生物素 - 鏈霉親和素系統(tǒng)的高靈敏度熒光檢測（免疫熒光、流式、印跡、原位雜交等）。
一、核心產(chǎn)品特性
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分子基礎(chǔ)
- 鏈霉親和素：源自 Streptomyces avidinii 的 53 kDa 同源四聚體蛋白，每亞單位具 1 個生物素結(jié)合位點。
- 結(jié)合力：Kd ≈ 10?1? M，非共價、高特異性、高親和力。
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熒光參數(shù)（AF647）
- Ex/Em：651 nm / 667 nm（遠(yuǎn)紅光，細(xì)胞自發(fā)熒光低）
- 亮度：強于 Cy5、DyLight 650，水溶性好、光穩(wěn)定性優(yōu)
- 適用儀器：共聚焦顯微鏡（633/647 nm 激光）、流式（APC 通道）、熒光掃描儀
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常見配方與保存
- 液體：1× PBS（pH 7.2–7.6），含 BSA、疊氮鈉（0.02–0.1%） 等穩(wěn)定劑
- 濃度：0.5–2 mg/mL（以 SA 計）
- 保存：2–8℃避光，不可凍融；未開封穩(wěn)定 1–2 年
二、適用場景
- 免疫熒光（IF/ICC）：生物素一抗 + AF647-SA 檢測
- 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）：細(xì)胞表面 / 胞內(nèi)抗原生物素化檢測
- Western Blot（WB）：生物素標(biāo)記一抗 / 二抗 + 熒光顯影
- 原位雜交（FISH）：生物素探針 + AF647-SA 信號放大
- 蛋白芯片、ELISA、細(xì)胞 / 組織標(biāo)記
三、標(biāo)準(zhǔn)使用方法（通用流程）
1. 工作液配制（關(guān)鍵）
- 稀釋液：1× PBS（pH 7.4）+ 0.05% Tween-20 + 1% BSA（或?qū)Ｓ梅忾]液）
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推薦工作濃度（參考，按品牌微調(diào)）
- 免疫熒光（IF）：1–5 μg/mL
- 流式（FCM）：0.5–2 μg/mL
- 印跡（WB）：1–10 ng/mL
- 原位雜交（FISH）：0.5–2 μg/mL
- 避光配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2. 免疫熒光（IF）典型步驟
- 樣品制備：固定、通透、封閉（3% BSA/PBST 30 min）
- 一抗孵育：生物素化一抗（4℃過夜 / RT 1h）
- 洗滌：PBST 3×5 min
- AF647-SA 孵育：RT 避光 30–60 min
- 洗滌：PBST 3×5 min → PBS 1×
- 復(fù)染 / 封片：DAPI 核染 → 抗淬滅封片
- 觀察：633/647 nm 激發(fā)，670/30 nm 通道采集
3. 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）步驟
- 細(xì)胞懸液 → 封閉（1% BSA/PBS 15 min）
- 加生物素化抗體（4℃ 30 min）
- 洗滌（PBS 2×）
- 加 AF647-SA 工作液（4℃避光 20–30 min）
- 洗滌 → 重懸 → 上機（APC/FL6 通道）
4. Western Blot 步驟
- 轉(zhuǎn)膜 → 封閉（5% 脫脂奶 1h）
- 生物素一抗 / 二抗孵育 → 洗滌
- AF647-SA（1–5 ng/mL）避光孵育 30–60 min
- 洗滌 → 熒光掃描（650 nm 激發(fā) / 670 nm 發(fā)射）
四、關(guān)鍵注意事項
- 避光：全程避光操作與保存，防光漂白。
- 不可凍融：冷凍致蛋白聚集、活性喪失。
- 封閉充分：用含生物素封閉劑（如 Avidin/Biotin Block）減少內(nèi)源性生物素背景。
- 濃度優(yōu)化：過高易非特異結(jié)合；過低信號弱。
- 兼容：可與 FITC、Cy3、Alexa 488/555/594 等多色復(fù)用。
五、常見問題與解決
- 背景高：封閉不足、洗滌不充分、濃度過高 → 降濃度、延長洗滌、加強封閉。
- 信號弱：一抗效價低、孵育時間短、染料降解 → 換新、延長孵育、避光。
- 熒光淬滅快：未用抗淬滅封片、激光太強 → 用抗淬滅、降低激光功率。
六、與同類產(chǎn)品對比
- AF647-SA vs Cy5-SA：AF647 更亮、更穩(wěn)定、水溶性更好、pH 不敏感。
- SA vs 親和素（Avidin）：SA 等電點中性（pI 5–6），非特異結(jié)合遠(yuǎn)低于 Avidin（pI 10）。
