Transfection Reagent 脂質體轉染試劑

產品描述

脂質體轉染試劑（Transfection Reagent）是一款多用途轉染試劑，適用于核酸（DNA、RNA）的轉染，能在絕大多數貼壁和懸浮細胞（哺乳動物細胞系）提供高效轉染。獨特的配方使其能直接加入培養基，血清的存在不會影響轉染效率。轉染后無需去除DNA- Lipo2000復合物或更換培養基，也可根據自身需求在轉染4-6h后更換新鮮培養基。

本品以無菌液體形式提供，濃度為1mg/ml。其使用方法和Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent基本一致，并且經過對HEK293、HeLa等細胞的轉染測試，轉染效率和Lipofectamine? 2000相當。

通常情況下，對于24孔板的DNA轉染，每次用2μl左右，則1.5mlLipo2000約可轉染750個孔；對于24孔板的siRNA轉染，每次用1μl左右，則1.5mlLipo2000約可轉染1500個孔；

保存與運輸方法

保存：+4℃保存，1年有效。切勿凍存。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）使用高純的DNA或RNA有助于獲得較高的轉染效率，內毒素是影響轉染效率高低的重要因素。

2）使用Lipo2000脂質體轉染試劑需確保高細胞密度，建議轉染時細胞密度達90-95%，有助于獲得最高轉染效率和表達水平，且能最小化高轉染活性導致的細胞生長降低影響。可通過優化實驗條件來降低細胞密度，但需注意不同實驗間維持一個標準的接種步驟，因轉染效率依賴于細胞培養密度。

3）轉染過程中不要添加抗生素到培養基，否則會導致細胞死亡。

4）為了獲得最佳的轉染效率，制備轉染復合物時要求用無血清培養基（比如Opti-MEM I）稀釋DNA和轉染試劑，因血清會影響復合物的形成。其他無血清培養基（比如DMEM）也能用來稀釋DNA和轉染試劑，但轉染效率有可能會降低。另外，需要特別注意某些無血清配方會抑制Lipo2000介導的轉染，比如CD293, SFMII, VP-SFM等。

5）初次使用制備復合物時，最好優化DNA（μg）和Lipo2000脂質體轉染試劑（μl）的比例。DNA和Lipo2000的比例，絕大多數細胞系通常推薦1:2-1:3，比如：24孔板內接種0.5-2×105個細胞，使用0.8-1μg DNA和2-3μL Lipo2000。通過調整DNA/ Lipo2000優化轉染效率很有必要。

6）Lipo2000脂質體轉染試劑應該在4℃保存，不可凍存。使用后立即蓋好蓋子，避免長時間暴露在空氣中，否則有可能導致脂質體氧化而影響轉染效率。

7）Lipo2000脂質體轉染試劑不能渦旋或離心，宜緩慢晃動混勻。

8）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

轉染步驟（以質粒DNA的24孔板為例）

【注意】：對大多數細胞來說，DNA（μg）和Lipo2000（μl）的比例為1:2~1:3。轉染時高的細胞密度可以得到高的轉染效率和表達水平，并能減少細胞毒性。

1. 細胞準備

1）貼壁細胞：轉染前一天，用500 μl不含抗生素的培養基接種細胞，使之在轉染時細胞達90-95%匯合（0.5~2×105 細胞/個孔，24孔板）。

2）懸浮細胞：轉染當天，于準備DNA-Lipo2000復合物之前，用500μl不含抗生素的培養基接種4~8×105細胞即可。

2.按照以下體系配制DNA- Lipo2000脂質體轉染試劑復合物：

1）對于每孔細胞，在EP管內分別加入50μl無血清培養基（比如Opti-MEM? I Reduced Serum Medium）和0.8 μg DNA輕柔混勻，制成DNA稀釋液。

2）對于每孔細胞，在EP管內分別加入50μl無血清培養基（比如Opti-MEM? I Reduced Serum Medium）和2.0 μl Lipo2000（注意用前先混勻），輕柔混勻，制成Lipo2000稀釋液，室溫靜置5min。【注意】：需要在30min內混合稀釋的DNA和Lipo2000，更長的等待時間會降低活性。如果使用DMEM作為稀釋培養基，那必須在5min內混合稀釋的DNA和Lipo2000。  

3）將DNA稀釋液和Lipo2000稀釋液混合（總體積100μl），輕柔混勻，室溫靜置20min， 形成DNA-Lipo2000復合物，這一混合物可能呈渾濁狀態，但不會抑制轉染效率。【注意】：DNA-Lipo2000復合物在室溫下至少可穩定保存5h。

3.將上方制備好的DNA-Lipo2000復合物加入接種好的細胞中，將培養板輕輕地前后搖動，使復合物分散均勻。【注意】：如果要在無血清條件下轉染，使用含血清的正常培養基進行細胞接種。再加入復合物前吸掉培養基，更換為500μl無血清培養基。

4. 37℃，5% CO2培養箱培養24-48h，直至能進行轉基因表達分析，無需去掉復合物或更換培養基。然而，有必要在4-6 h后更換生長培養基，不會降低轉染活性。

5.特殊說明

1）對于穩轉細胞株：則在轉染24h后，按照1:10或更高比例接種細胞到新鮮生長培養基。轉染48h后加入篩選培養基。

2）對于懸浮細胞株：在細胞中加入DNA-Lipo2000復合物后，如需要可以4h后加入PMA和/或PHA。比如：對于Jurkat細胞，分別加入PHA-L（終濃度1μg/ml）和PMA（終濃度50ng/ml），可以提高CMV啟動子活性和基因表達。對于K562細胞，只加入PMA（終濃度50ng/ml）足以提高啟動子活性。

轉染體系的放大或縮小

對于不同的細胞培養板，Lipo2000、DNA、細胞和培養基的使用量根據培養表面的不同按比例進行調整，具體參考表I。對于自動化、高通量體系，以96孔板形式制備更大的復合物體積。需要注意的是，需要進行快速的96孔板轉染（細胞鋪板和轉染同時進行），直接在平板中制備復合物，然后將細胞懸液加入到復合物內，這樣進一步減少了轉染時間。此種改進步驟經過293-H，293-F，COS-7L和CHO細胞的試驗，同傳統方法相比活性稍低。

表I.不同細胞培養容器中轉染時培養基、核酸及Lipo2000用量

【*】：不同廠商提供的細胞培養容器表面積可能有所不同。

【**】：稀釋DNA/RNA或Lipo2000所用的無血清培養基用量。

【注意】：該表用量僅供參考，具體用量請根據細胞類型、鋪板密度等其他實驗條件進行優化。

附表II  Lipo2000脂質體轉染試劑用于不同細胞轉染用量參考（以96孔板為例）