AF488（綠色） NHS酯 等同于Alexa Fluor 488
AF488（綠色）NHS 酯即Alexa Fluor 488 NHS 酯（N - 羥基琥珀酰亞胺酯，又稱 SE），是 Alexa Fluor 488 熒光染料的活性衍生物，可與含伯胺的生物分子共價結合，實現綠色熒光標記。以下是核心信息與標準化操作流程。
一、核心信息
1. 等同關系與化學本質
- 等同關系：AF488（綠色）NHS 酯 = Alexa Fluor 488 NHS 酯，二者為同一產品，僅簡稱不同。
- 化學本質：以磺化羅丹明為熒光核心，帶 NHS 活性酯基團，可與賴氨酸 ε- 氨基、多肽 N 端氨基等伯胺形成穩定酰胺鍵。
2. 關鍵理化與光譜特性
| 項目 | 參數 |
|---|---|
| 激發波長（Ex） | 495 nm（匹配 488 nm 激光） |
| 發射波長（Em） | 518–519 nm |
| 量子產率 | ≥0.9（高亮度） |
| pH 穩定性 | 4–10（熒光信號穩定） |
| 光穩定性 | 優異，抗光漂白 |
| 溶解性 | 易溶于 DMSO、DMF；水溶液中易水解，需現配現用 |
| 分子量 | 約 631.02 |
| CAS 號 | 222164-96-7 |
3. 核心優勢
- 亮度、光穩定性顯著優于 FITC，背景信號低。
- 水溶性強、自淬滅傾向低，多標記蛋白仍保持高熒光。
- 光譜與 FITC 兼容，無需更換顯微鏡濾光片。
4. 適用對象
可標記蛋白質、抗體、多肽、氨基修飾寡核苷酸 / 核酸等含伯胺的生物分子。
二、標準化使用方法（以抗體標記為例）
1. 試劑與耗材準備
- AF488 NHS 酯粉末、無水 DMSO（或 DMF）、0.1 M NaHCO?緩沖液（pH 8.3，標記緩沖液）、PBS（pH 7.4）、Sephadex G-25 脫鹽柱 / PD-10 柱 / 超濾離心管（10 kDa 截留）。
- 待標記抗體：濃度≥2 mg/mL，不含 Tris、甘氨酸、銨鹽、BSA等含胺成分（含胺需先透析至 PBS）。
2. 操作步驟
（1）染料儲備液配制
- 用無水 DMSO 溶解 AF488 NHS 酯，配制成10 mg/mL（約 15.8 mM） 儲備液，避光分裝，-20℃保存（避免反復凍融）。
（2）標記反應
- 取抗體溶液（如 1 mg，濃度≥2 mg/mL），加入0.1 M NaHCO?緩沖液（pH 8.3） 調至適宜體積，確保終濃度≥2 mg/mL。
- 按染料：蛋白摩爾比 10:1（推薦范圍 5:1–20:1，需預實驗優化）緩慢加入染料儲備液，輕柔混勻。
- 室溫避光孵育 30–60 分鐘（溫度敏感蛋白可 4℃過夜，提升活性保留率）。
（3）終止與純化
- 終止：NHS 酯在水中自發水解，無需額外終止；或加入 10 倍摩爾量甘氨酸 / Tris 封閉未反應位點。
- 純化：用脫鹽柱（Sephadex G-25/PD-10）或超濾離心管去除游離染料，收集標記產物。
3. 關鍵注意事項
- 全程避光：熒光染料易光漂白，操作需在暗室或避光條件下進行。
- 避免含胺緩沖液：Tris、甘氨酸、銨鹽會競爭反應位點，嚴重降低標記效率。
- 現配現用：染料溶解于水后快速水解失效，僅能溶于無水 DMSO/DMF 儲存。
- 標記比例優化：摩爾比過高易導致蛋白聚集 / 活性下降，建議測試 5:1、10:1、20:1 三組條件。
- 活性驗證：通過紫外分光光度法（A280/A495 比值）或熒光強度評估標記效率，理想每個蛋白偶聯 1–3 個染料分子。
三、常見應用場景
- 免疫熒光（IF）：標記抗體用于細胞內 / 表面蛋白定位。
- 流式細胞術：多色分析中作為綠色通道標記。
- Western Blot/ELISA：檢測特定蛋白表達水平。
- 核酸標記：標記氨基修飾 DNA/RNA 探針，用于 FISH 等實驗。
四、儲存條件
- 粉末：-20℃干燥、避光保存，有效期 12 個月以上。
- 儲備液：DMSO 溶解后分裝，-20℃避光，6 個月內穩定。
- 標記產物：4℃短期保存，長期 - 20℃避光，避免反復凍融。
